? ? ? 近年來，抗體和抗體片段在生物大分子治療和診斷領(lǐng)域備受關(guān)注，很多抗體類藥物已經(jīng)步入商業(yè)化生產(chǎn)階段。相較于完整的抗體，抗體片段分子量低，組織滲透性好，少有復(fù)雜的糖基化結(jié)構(gòu)，可以使用多種原核或真核細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)進(jìn)行表達(dá)，已成為很多生物技術(shù)公司的研究熱點(diǎn)。與完整的抗體不同，很多抗體片段分子結(jié)構(gòu)中沒有Fc端，無法用傳統(tǒng)的Protein A親和層析填料進(jìn)行捕獲，而Protein L親和層析填料，由于可以結(jié)合抗體輕鏈的可變區(qū)域，為抗體片段的捕獲提供了可靠的技術(shù)手段。但市面上常見的Protein L親和層析填料穩(wěn)定性普遍較低，填料無法耐受高濃度堿液的清潔，配基脫落嚴(yán)重，且價(jià)格昂貴，給純化工藝帶來了極大的挑戰(zhàn)。

????????? FabsorbentTM F1P HF是Astrea Bioseparations公司近年來推出的親和層析填料，填料基架是粒徑均一的高交聯(lián)瓊脂糖，基架上修飾有化學(xué)合成的小分子配基，可以高效捕獲各種抗體片段分子。相較于Protein L親和層析填料，FabsorbentTM F1P HF的結(jié)合范圍更廣泛，填料可以耐受高達(dá)1M NaOH的清潔，其主要優(yōu)勢(shì)特點(diǎn)歸納如下：

• 結(jié)合范圍廣，既可以結(jié)合kappa型輕鏈，也可以結(jié)合lambda型輕鏈，對(duì)一些非人源性的抗體（如鼠源性、牛源性、羊源性等）也有一定的結(jié)合能力，可廣泛地用于F(ab’)2, Fab, scFv, VL, IgG的捕獲。
• 小分子化學(xué)合成配基，無動(dòng)物源性，穩(wěn)定性好，安全性高。
• 填料可以耐受0.5-1M NaOH的清潔和消毒，清潔效果好，壽命長(zhǎng)。

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應(yīng)用案例1：FabsorbentTM F1P HF捕獲F(ab’)2抗體片段

?????????? 在該測(cè)試案例中，研究人員使用胃蛋白酶將完整的IgG水解為Fc和F(ab’)2片段，并上樣到FabsorbentTM F1P HF層析柱中，工藝參數(shù)如下表所示：

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由圖1的層析圖譜和圖2的SDS-PAGE電泳圖譜可以看出，FabsorbentTM F1P HF可以高效捕獲料液中的F(ab’)2片段，經(jīng)洗脫后，得到高純度的F(ab’)2分子，層析前添加的胃蛋白酶可被有效去除。

圖1：FabsorbentTM F1P HF捕獲F(ab’)2的層析圖譜

圖2：SDS-PAGE電泳圖譜（Lane 1是molecular weight marker；Lane 2是IgG標(biāo)準(zhǔn)品；Lane 3是胃蛋白酶水解后料液；Lane 4是流穿和淋洗液；Lane 5是洗脫液。）

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應(yīng)用案例2：FabsorbentTM F1P HF捕獲CHO表達(dá)的Fab抗體片段

????? ??? 在該應(yīng)用案例中，研究人員使用CHO細(xì)胞表達(dá)Fab抗體片段，細(xì)胞收獲液經(jīng)澄清后，上樣到FabsorbentTM F1P HF層析柱中，工藝參數(shù)如下表所示：

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????????? 測(cè)試還研究了不同的洗脫工藝條件，測(cè)試1采用了pH 3.0的等度洗脫方式，測(cè)試2采用了pH 4.0的等度洗脫方式，測(cè)試3先采用pH 9.0的甘氨酸緩沖液進(jìn)行上樣后的淋洗，隨后用pH 4.0的醋酸鹽緩沖液進(jìn)行等度洗脫。

? ??????? 由圖4的SDS-PAGE電泳圖譜可以看出，FabsorbentTM F1P HF可以有效捕獲細(xì)胞收獲液中的Fab抗體片段。三種洗脫方式均可以確保大于90%的目標(biāo)Fab純度，且回收率極高。其中，在測(cè)試2的洗脫條件下，Fab純度和回收率最高。在測(cè)試3的條件下，洗脫前使用pH 9.0的甘氨酸緩沖液淋洗能去除少量非特異性結(jié)合的雜質(zhì)蛋白。

圖3：FabsorbentTM F1P HF捕獲Fab的層析圖譜（測(cè)試2）

圖4：SDS-PAGE電泳圖譜（Lane 1是molecular weight marker；Lane 2是純化后的Fab對(duì)照品；Lane 3澄清后的CHO細(xì)胞收獲液；Lane 4是測(cè)試1的流穿液；Lane 5是測(cè)試1 的洗脫液；Lane 6是測(cè)試2的流穿液；Lane 7是測(cè)試2的洗脫液；Lane 8是測(cè)試2的再生液（citrate, pH 3.0）；Lane 9是測(cè)試3的流穿液；Lane 10是測(cè)試3的淋洗液；Lane 11是測(cè)試3的洗脫液。）

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應(yīng)用案例3： FabsorbentTM F1P HF捕獲E.coli表達(dá)的VL抗體片段

????????? 在該應(yīng)用案例中，研究人員使用E.coli表達(dá)VL抗體片段，經(jīng)細(xì)胞裂解和澄清后，直接上樣到FabsorbentTM F1P HF層析柱中，工藝參數(shù)如下表所示：

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????????? 由圖5的層析圖譜和圖6的SDS-PAGE電泳圖譜可以看出，FabsorbentTM F1P HF可以有效捕獲復(fù)雜料液中的VL抗體片段，大量雜質(zhì)蛋白在上樣和淋洗過程中被去除，經(jīng)洗脫后，可以得到純度極高的目標(biāo)分子VL。

圖5：FabsorbentTM F1P HF捕獲VL的層析圖譜

圖6：SDS-PAGE電泳圖譜（Lane 1是molecular weight marker；Lane 2是澄清后的E.coli裂解液；Lane 3是流穿液；Lane 4是淋洗液；Lane 5是洗脫液；Lane 6是清潔液。）

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FabsorbentTM F1P HF親和層析填料的技術(shù)參數(shù)

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FabsorbentTM F1P HF親和層析填料產(chǎn)品信息

散裝填料

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預(yù)裝柱

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參考資料：

1. S. Kittler et al., Protein L-more than just an affinity ligand, 2021
2. Brochure: Purify and capture of antibody fragments with a new synthetic ligand affinity adsorbent FabsorbentTM F1P HF, Astrea Bioseparations
3. Technical Note: Fab and F(ab’)2 fragment purification from CHO cell culture supernatant using Fabsorbent? F1P HF, Astrea Bioseparations
4. Technical User Guide: FabsorbentTM F1P HF, Astrea Bioseparations

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Astrea Bioseparations于1987年孵化自劍橋大學(xué)，擁有超過30年層析介質(zhì)研發(fā)和生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)，是世界級(jí)層析介質(zhì)產(chǎn)品與服務(wù)供應(yīng)商。目前使用Astrea的產(chǎn)品已有超過21個(gè)生產(chǎn)工藝通過了FDA和EMA的批準(zhǔn)。Astrea Bioseparations在全球擁有3個(gè)研發(fā)和生產(chǎn)基地，專注為生物大分子和CGT領(lǐng)域提供行業(yè)領(lǐng)先的層析介質(zhì)和技術(shù)服務(wù)。Astrea Bioseparations推出的基于納米纖維的新型層析技術(shù)，解決了傳統(tǒng)生物分離工具載量低和工藝耗時(shí)問題，實(shí)現(xiàn)更快、更環(huán)保、更具成本效益的純化過程，完全符合當(dāng)今生物治療創(chuàng)新的需求。

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